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技術(shù)文章
培養(yǎng)干細(xì)胞的凍存
2017
8-1干細(xì)胞低溫凍存是培養(yǎng)室常規(guī)工作和通用技術(shù)。細(xì)胞凍存在-196℃液氮中，儲(chǔ)存時(shí)間幾乎是無(wú)限的。細(xì)胞凍存及復(fù)蘇的原則是慢凍快融。1．凍存細(xì)胞（1）選對(duì)數(shù)增生期細(xì)胞(證明無(wú)支原體污染)，在凍存前1d換液。（2）按常規(guī)方法把培養(yǎng)細(xì)胞制備成懸液，計(jì)數(shù)，使細(xì)胞密度達(dá)5×107／ml左右密度，離心，去上清。（3）加入配制好的凍存液（培養(yǎng)液6.8ml，小牛血清2ml，DMSO1ml，5.6%NaHCO30.1ml），按與去上清相同的量一滴一滴加入離心管中，然后用吸管輕輕吹打令細(xì)胞重懸。凍存細(xì)...+ -
技術(shù)文章
細(xì)胞計(jì)數(shù)與存活的測(cè)試實(shí)驗(yàn)方法
2017
7-27腫瘤細(xì)胞冷凍與復(fù)蘇是細(xì)胞培養(yǎng)的常規(guī)工作，可以解決細(xì)胞因?yàn)檫B續(xù)繼代造成的退變或轉(zhuǎn)化。細(xì)胞的原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)以及細(xì)胞凍存和復(fù)蘇后都需要細(xì)胞計(jì)數(shù)。那么細(xì)胞計(jì)數(shù)與存活的測(cè)試實(shí)驗(yàn)方法有哪些呢？1、原理：（1）計(jì)算細(xì)胞數(shù)目可用血球計(jì)數(shù)盤(pán)或是Coultercounter粒子計(jì)數(shù)器自動(dòng)計(jì)數(shù)。（2）血球計(jì)數(shù)盤(pán)一般有二個(gè)chambers，每個(gè)chamber中細(xì)刻9個(gè)1mm2大正方形，其中4個(gè)角落之正方形再細(xì)刻16個(gè)小格，深度均為0.1mm。當(dāng)chamber上方蓋上蓋玻片后，每個(gè)大正方形之體積為...+ -
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轉(zhuǎn)化細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)中的準(zhǔn)備工作
2017
7-25一、轉(zhuǎn)化細(xì)胞準(zhǔn)備工作準(zhǔn)備工作對(duì)開(kāi)展細(xì)胞培養(yǎng)異常重要，推備工作中某一環(huán)節(jié)的疏忽可導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗或無(wú)法進(jìn)行。準(zhǔn)備工作的內(nèi)容包括器皿的清洗、干燥與消毒，培養(yǎng)基與其他試劑的配制、分裝及滅菌，無(wú)菌室或超凈臺(tái)的清潔與消毒，培養(yǎng)箱及其他儀器的檢查與調(diào)試等。1、清潔、消毒、液體直接接觸細(xì)胞的用品要超凈處理——無(wú)非必須分子直接接觸細(xì)胞的用品要*消除微生物超凈和消毒過(guò)的樣品要密閉保存，標(biāo)記消毒時(shí)間實(shí)驗(yàn)室保持潔凈，隨時(shí)消毒盡量采用商品化一次性用品操作者也要清潔和消毒緩沖液要符合生理滲透壓（280～3...+ -
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體外培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞生物學(xué)檢測(cè)
2017
7-20一旦培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)成形態(tài)上單一的細(xì)胞群體或細(xì)胞系（或株）后，不論用于實(shí)驗(yàn)研究還是建立細(xì)胞系，都需要做一系列的細(xì)胞生物學(xué)測(cè)定，主要的目的在于求得證明：所培養(yǎng)的細(xì)胞系的確來(lái)源于原體內(nèi)具有惡性的細(xì)胞，而非正常細(xì)胞或其它細(xì)胞。均具有瘤種特異性。闡明一般生物學(xué)性狀。測(cè)定項(xiàng)目數(shù)量無(wú)明確規(guī)定，根據(jù)需要而定，以下為常做的項(xiàng)目和要點(diǎn)。【形態(tài)觀察】主要觀察細(xì)胞的一般形態(tài)，如大體形態(tài)、核漿比例、染色質(zhì)和核仁大小、多少等以及細(xì)胞骨架微絲微管的排列狀態(tài)等。【細(xì)胞生長(zhǎng)增殖】檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)曲線、細(xì)胞分裂...+ -
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間質(zhì)干細(xì)胞成脂和成骨誘導(dǎo)分化
2017
7-18成骨和成脂誘導(dǎo)是鑒定干細(xì)胞的一種重要的方法，也是zui常用、報(bào)道見(jiàn)得zui多的方法。成骨zui常用的染色方法是茜素紅染色（堿性磷酸酶），成脂誘導(dǎo)zui常用是OilRedO（油紅O）染色法。下面介紹一下這兩種染色方法的原理和步驟。成骨誘導(dǎo)分化茜素紅染色方法和原理：茜素紅又名茜素磺酸鈉，茜素S，茜素紅S，茜素胭脂紅，1,2-二羥基蒽醌-3-磺酸鈉，1,2-二羥基蒽醌-3-磺酸鈉鹽。橙黃色或黃棕色粉末。易溶于水，微溶于乙醇，不溶于苯。1%水溶液pH為2.15，其水溶液呈淺黃褐色，加...+ -
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轉(zhuǎn)化細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)的操作方式
2017
7-13轉(zhuǎn)化細(xì)胞深層培養(yǎng)可分為：分批式、流加式、半連續(xù)式、連續(xù)式、連續(xù)式和灌注式五種。一、分批式培養(yǎng)（batchculture）是細(xì)胞規(guī)模培養(yǎng)發(fā)展進(jìn)程中較早期采用的方式，也是其它操作方式的基礎(chǔ)。該方式采用機(jī)械攪拌式生物反應(yīng)器，將細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)后，一次性轉(zhuǎn)入生物反應(yīng)器內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，在培養(yǎng)過(guò)程中其體積不變，不添加其它成分，待細(xì)胞增長(zhǎng)和產(chǎn)物形成積累到適當(dāng)?shù)臅r(shí)間，一次性收獲細(xì)胞、產(chǎn)物、培養(yǎng)基的操作方式。該方式的特點(diǎn):操作簡(jiǎn)單。培養(yǎng)周期短，染菌和細(xì)胞突變的風(fēng)險(xiǎn)小。反應(yīng)器系統(tǒng)屬于封閉式，培養(yǎng)過(guò)程中與...+ -
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腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)方法
2017
7-11腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)成功關(guān)鍵在于：取材、成纖維細(xì)胞的排除、選用適宜的培養(yǎng)液和培養(yǎng)底物等幾個(gè)方面。在具體培養(yǎng)方法方面，腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)與正常組織細(xì)胞培養(yǎng)并無(wú)原則差別，初代培養(yǎng)應(yīng)用組織塊和消化培養(yǎng)法均可。1、取材：人腫瘤細(xì)胞來(lái)自外科手術(shù)或活檢瘤組織。取材部位非常重要，體積較大的腫瘤組織中有退變或壞死區(qū)，取材時(shí)盡量避免用退變組織，要挑選活力較好的部位。癌性轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)或胸腹水是好的培養(yǎng)材料。取材后宜盡快進(jìn)行培養(yǎng)，如因故不能立即培養(yǎng)，可貯存于4℃中，但不宜栽過(guò)24小時(shí)。2、培養(yǎng)基：腫瘤細(xì)胞對(duì)培養(yǎng)基...+ -
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ATCC細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)介紹
2017
7-6ATCC細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法不同，對(duì)轉(zhuǎn)染結(jié)果影響很大。常見(jiàn)的轉(zhuǎn)染方法有：1.磷酸鈣法：該方法利用磷酸鈣DNA復(fù)合物吸附細(xì)胞膜被細(xì)胞內(nèi)吞原理得到瞬時(shí)或穩(wěn)定轉(zhuǎn)染結(jié)果，操作簡(jiǎn)便但重復(fù)性差，不可用于原代細(xì)胞的轉(zhuǎn)染。2.DEAE-右旋糖苷法：帶正電的DEAE-右旋糖苷與核酸帶負(fù)電的磷酸骨架相互作用形成的復(fù)合物被細(xì)胞內(nèi)吞，可用于瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，方法相對(duì)簡(jiǎn)便、結(jié)果可重復(fù)但對(duì)細(xì)胞有一定的毒副作用。3.電穿孔法：利用高脈沖電壓破壞細(xì)胞膜電位，DNA通過(guò)膜上形成的小孔導(dǎo)入。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染均適用。適用性廣但...+ -
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細(xì)胞死亡的檢驗(yàn)方式
2017
7-4ATCC細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)具有固有的形態(tài)特征,如細(xì)胞核表現(xiàn)縮小、染色質(zhì)邊緣化、凝集,凋亡晚期還會(huì)出現(xiàn)由核碎片與胞質(zhì)內(nèi)的部分細(xì)胞器混合在一起,且被細(xì)胞膜包裹形成的凋亡小體。DNA特異性染料(如Hoechst33342、Hoechst33258和DAPI等)可以與DNA的A-T堿基區(qū)進(jìn)行非嵌入式結(jié)合,從而使細(xì)胞核著色,在紫外光激發(fā)時(shí)會(huì)出現(xiàn)明顯的熒光。通過(guò)熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡可以觀察細(xì)胞染色質(zhì)的形態(tài)學(xué)變化、膜結(jié)構(gòu)及通透性的改變,從而鑒別凋亡細(xì)胞、正常細(xì)胞及壞死細(xì)胞。細(xì)胞凋亡的形...+ -
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細(xì)胞分裂指數(shù)操作說(shuō)明書(shū)
2017
6-29【實(shí)驗(yàn)用品】材料：貼壁培養(yǎng)的ATCC細(xì)胞器材：離心機(jī)、顯微鏡、血細(xì)胞計(jì)數(shù)板試劑：Hanks液、0．25％胰蛋白酶、含10％小牛血清／胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基(根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要也可以是其他種類(lèi)的培養(yǎng)基)【實(shí)驗(yàn)步驟】(1)用胰蛋白酶消化處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的單層培養(yǎng)細(xì)胞，細(xì)胞置于10ml離心管中，1000r／min離心5min，棄上清。(2)加入含血清的DMEM培養(yǎng)基，制備單細(xì)胞懸液。(3)吹打均勻后，對(duì)ATCC細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。(4)按2x104～5x104／ml的密度將細(xì)胞接種到24孔細(xì)胞...+ -
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細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的繪制操作步驟
2017
6-27ATCC細(xì)胞實(shí)驗(yàn)用品材料：貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞器材：24孔培養(yǎng)孔板、吸管、膠帽、離心管、培養(yǎng)皿、半對(duì)數(shù)坐標(biāo)紙、蓋玻片、細(xì)胞計(jì)數(shù)板、酒精棉球、酒精燈、離心機(jī)、倒置顯微鏡、普通光學(xué)顯微鏡、超凈工作臺(tái)、CO2培養(yǎng)箱試劑：Hanks液、DMEM培養(yǎng)基(含10％小牛血清)、0.25％胰蛋白酶消化液、吉姆薩染液實(shí)驗(yàn)步驟(1)消化：用0．25％胰蛋白酶溶液消化處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的單層培養(yǎng)細(xì)胞，收集消化的細(xì)胞于10ml離心管中。(2)離心：500～1000r／min離心5min，棄上清。(3)加入DM...+ -
技術(shù)文章
分析培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞狀態(tài)欠佳的原因
2017
6-221、腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)基的新鮮程度：一般加入血清后的*培養(yǎng)基，2周內(nèi)用完。否則血清有效成分失活，影響細(xì)胞培養(yǎng)。建議：*培養(yǎng)基一次不要配太多，200ml以下?；蚋鶕?jù)用量決定。2、細(xì)胞外源微生物的污染：細(xì)胞不宜長(zhǎng)期體外培養(yǎng)，因?yàn)橥庠次⑸镂廴镜膸茁蚀蟠筇岣摺Ｒ装l(fā)現(xiàn)和難發(fā)現(xiàn)的。影響細(xì)胞狀態(tài)。建議：實(shí)驗(yàn)前凍存一批細(xì)胞，隔幾個(gè)月重新復(fù)蘇。即保證實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞代數(shù)一致，又將外源污染的后果降到zui低。3、排除其他原因：如更換培養(yǎng)條件（血清、培養(yǎng)基等）；腫瘤細(xì)胞使用器皿的潔凈程度；人表皮黑色素細(xì)胞...+
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