熒光探針PCR試劑盒(Fluorescence Probe-based PCR Kit)是一種在??實時定量聚合酶鏈式反應（Real-Time Quantitative PCR，簡稱qPCR 或 RT-qPCR）??中廣泛使用的檢測工具，其核心是通過??熒光信號的變化實時監測PCR擴增過程??，從而實現對目標核酸(DNA或cDNA)的??定性檢測、定量分析以及靈敏度的檢測??。
  

　　下面從基本原理、關鍵組成、工作流程與技術特點等方面詳細闡述熒光探針PCR試劑盒的基本原理。
 

　　一、基本原理概述
 

　　熒光探針PCR試劑盒的基本原理是：
 

　　??在常規PCR反應的基礎上，引入一種特異性熒光標記的探針，在PCR擴增過程中，該探針與目標DNA模板特異性結合，并在DNA聚合酶的作用下被切割，釋放出熒光信號；通過實時檢測熒光信號的強度變化，從而實現對目標核酸的定量或定性分析。??
 

　　簡單來說，就是：
 

　　??有目標核酸 → PCR擴增 → 探針結合并被切割 → 熒光信號增強 → 信號與核酸量成正比 → 定量/定性判斷。??
 

　　二、熒光探針PCR vs 常規PCR
  

　　三、熒光探針PCR試劑盒的關鍵組成
 

　　一個典型的熒光探針PCR試劑盒通常包含以下核心試劑和成分：
 

　　??引物（Primers）??
 

　　一對特異性寡核苷酸序列，用于擴增目標DNA的特定區域；
 

　　設計需高度特異，以確保只擴增目標序列。
 

　　??熒光探針（Fluorescent Probe）??
 

　　是熒光探針PCR的核心元件，一般為??寡核苷酸探針??，長度通常為20~30個堿基；
 

　　探針特異性結合在??目標DNA序列的引物擴增區域之間??；
 

　　探針本身帶有：
 

　　??報告基團（Reporter, R）??：發熒光基團(如FAM、HEX、ROX等)；
 

　　??淬滅基團（Quencher, Q）??：吸收報告基團熒光的基團(如TAMRA、BHQ等)；
 

　　?? ??關鍵機制：在完整狀態下，報告基團與淬滅基團靠近，熒光被淬滅幾乎無信號；當探針被DNA聚合酶切割后，兩者分離，熒光信號釋放并增強。??
 

　　??DNA聚合酶（如Taq酶）??
 

　　具有5'→3'聚合活性和??5'→3'外切酶活性（關鍵?。??，用于切割探針；
 

　　是實現“探針切割→熒光釋放”的必要條件。
 

　　??dNTPs??
 

　　包括dATP、dTTP、dCTP、dGTP，為PCR擴增提供原料。
 

　　??PCR反應緩沖體系??
 

　　提供適宜的pH、Mg²?濃度等，保障PCR反應高效進行。
 

　　??陽性對照 / 陰性對照 / 內參（可選）??
 

　　用于質控實驗是否正常，判斷結果的可靠性。
 

　　四、熒光探針PCR的工作流程與原理詳解
 

　　Step 1：反應體系配制
 

　　將目標核酸模板(如DNA或cDNA)、引物、熒光探針、Taq酶、dNTPs、緩沖液等混合，構成完整的PCR反應體系。
 

　　Step 2：PCR擴增循環(在實時熒光PCR儀中進行)
 

　　PCR過程一般分為三個步驟，循環進行(通常30~45個循環)：
 

　　??變性（Denaturation）??：94–95°C，約10~30秒
 

　　→ 雙鏈DNA解開成單鏈，為引物和探針結合提供模板。
 

　　??退火（Annealing）??：50–65°C(依引物Tm值而定)，約20~30秒
 

　　→ 引物和熒光探針特異性地結合到目標DNA序列的對應區域上。
 

　　?? 探針此時完整地結合在目標序列上，報告基團與淬滅基團靠近，??熒光幾乎不釋放??。
 

　　??延伸（Extension）??：72°C，約30~60秒
 

　　→ ??Taq酶從引物3'端開始合成新鏈，同時其5'→3'外切酶活性將探針從5'端逐步“切割”下來。??
 

　　?? ??探針被切斷后，報告基團與淬滅基團分離 → 熒光信號釋放！??
 

　　?? ??每成功擴增一個目標DNA分子，就會產生一個探針切割事件 → 釋放一份熒光信號。??
 

　　Step 3：實時檢測熒光信號
 

　　PCR儀器會在每個循環的延伸階段或之后檢測熒光強度；
 

　　隨著循環數增加，目標DNA數量呈指數增長 → 熒光信號也逐步增強；
 

　　通過檢測??熒光信號的增長曲線??，可以實時反映PCR產物的積累過程。
 

　　五、熒光信號與目標核酸量的關系
 

　　在PCR初期(循環數較少時)，目標DNA少，熒光信號微弱，處于??基線期（Baseline）??；
 

　　當目標DNA達到一定數量后，熒光信號顯著上升，進入??指數擴增期（Exponential Phase）??；
 

　　最終進入平臺期(Plateau)，反應試劑耗盡，信號趨于平穩。
 

　　?? ??Ct值（Cycle Threshold）??：
 

　　是指熒光信號超過背景閾值時的PCR循環數；
 

　　??Ct值與起始模板量成反比??：起始模板越多，Ct值越??；反之則越大；
 

　　通過Ct值可對樣本中的目標核酸進行??相對或絕對定量分析??。
 

　　六、常見的熒光探針類型

類型	說明	應用
??TaqMan 探針??	最常見，5'報告基團 + 3'淬滅基團，依賴Taq酶5'→3'外切酶活性切割	病原檢測、基因表達、SNP分型等
??分子信標（Molecular Beacon）??	發夾型探針，依靠自身結構實現淬滅，與目標結合后構象改變釋放熒光	實時監測、SNP分析
??FRET探針（熒光共振能量轉移）??	雙探針系統，能量從供體轉移到受體，切割后能量傳遞中斷	多重檢測、高特異性需求場景

 

　　其中，??TaqMan探針是常用的一種，也是大多數商用熒光PCR試劑盒所采用的方案。??
 

　　七、熒光探針PCR試劑盒的典型應用
 

　　??病原微生物檢測??
 

　　新冠病毒(SARS-CoV-2)、乙肝病毒(HBV)、HPV、結核桿菌等核酸檢測；
 

　　??基因表達分析??
 

　　檢測特定mRNA的表達水平，研究基因功能；
 

　　??轉基因檢測 / 動植物疫病檢測??
 

　　檢測特定基因序列是否存在；
 

　　??SNP（單核苷酸多態性）分析??
 

　　基因分型、個體化用藥指導；
 

　　??腫瘤相關基因檢測??
 

　　如EGFR突變、KRAS突變等；
 

　　??食品安全與動物源性檢測??
 

　　檢測肉類摻假、致病菌污染等。
 

　　八、總結：熒光探針PCR試劑盒基本原理一句話概括
 

　　??熒光探針PCR試劑盒通過在PCR反應體系中引入特異性熒光標記探針，在DNA擴增過程中利用Taq酶切割探針釋放熒光信號，從而實現對目標核酸的實時監測、高靈敏度與高特異性的定性與定量分析。??