分離失敗通常源于?樣品質量、操作細節或設備問題?，下面梳理了關鍵點：

一、樣品相關問題

?細胞狀態差?：死細胞或受損細胞比例高會釋放大量雜質，干擾分離。

?起始細胞量不足?：樣品量太少導致最終得率極低，難以檢測。

?組織處理不當?：組織樣本若未充分均質化或消化，會影響細胞核釋放效率。

二、操作過程問題

?裂解不充分或過度?：

?不充分?：細胞膜未破裂，核釋放不。

?過度?：破壞核膜完整性，導致核碎片化。

?離心參數不匹配?：

?轉速/時間不足?：核無法沉淀，留在上清中。

?轉速/時間過長?：可能導致核膜破裂或雜質共沉淀。

?溫度控制不當?：未在4℃低溫操作，激活核酸酶降解DNA/RNA。

?緩沖液問題?：

?成分錯誤?：如缺乏蛋白酶抑制劑或RNase抑制劑。

?pH值不準?：影響核穩定性。

?反復凍融?：破壞緩沖液平衡。

三、設備與耗材問題

?離心機校準偏差?：實際轉速與設定值不符，影響分離效果。

?轉子或離心管不匹配?：使用不能承受高轉速的耗材，導致破裂或泄漏。

?設備未預冷?：離心腔或轉子未提前至4℃，造成溫度波動。

四、其他常見問題

?樣品粘稠度高?：未充分稀釋或DNase處理，導致沉淀不均一。

?交叉污染?：移液槍頭、離心管等未更換，造成樣品間污染。

?缺乏預實驗優化?：未針對特定細胞類型優化裂解和離心條件。

?優化建議?：設置陽性對照（如已知分離良好的樣本），每步操作后取樣鏡檢，優化時每次只改變一個變量。